HEK293细胞转染方法与结果分析

更新时间:2022-10-07 12:56:01 | 来源:乐鱼体育最新版下载 作者:乐鱼体育线下投注
  

  5. 第二天,培养基完全被补充有 4% (v/v) IgG 剥离 FCS (PAA) 和青霉素/链霉素的 DMEM 替代,以较大限度地减少蛋白质 A/G 亲和层析对牛 IgG 的共纯化。

  6. 通常每天收获和更换培养基长达两周。每天收获和更换生产培养基长达 1-2 周。

  2. 对于小规模生产,将 12 孔板中的 1 mL/孔在线 rpm 的速度孵育。如果没有另外说明,应当在 1/10 体积的新鲜无血清培养基中制备总计 1 μg 高质量质粒 DNA 和 2.5 μg PEI/mL 培养体积。

  4. 加入 DNA/PEI 复合物后,将细胞进一步培养 48 小时。然后按照其他方法与另外体积的新鲜培养基一起添加终了浓度为 0.5% (w/v) 的胰蛋白胨 N1。

  通常在转染后 48 小时使用流式细胞仪来测量转染效率。通过荧光 (FL) 1 中 GFP(pTTo/GFPq、NRC、BRI;总质粒 DNA 的 5%)或 YFP 的共表达来检测转染的细胞。用 2 μg/mL 碘化丙啶对死细胞进行染色。

  SDS-PAGE 可以使用天能相关的试剂及电泳槽进行电泳分离。蛋白质标准品和样品在还原条件下用 Laemmli 样品缓冲液在 95°C 下制备 5 分钟,或在非还原条件下(不含还原剂的 Laemmli 样品缓冲液)在 65°C 下制备 10 分钟。使用SDS-PAGE进行凝胶电泳操作。然后进行考马斯染色。再通过 IgG/Fc 捕获 ELISA 和凝胶光密度法定量 scFv-Fc 抗体。

  通过IgG/Fc捕获ELISA对生产上清液中的抗体进行定量的简要步骤如下:

  1. 将总共 100 μL/孔山羊抗人免疫球蛋白(多价)捕获抗体(200 ng/mL)在 PBS 中稀释并包被在 96 孔微量滴定板中在 37°C 下 1 小时。

  5. 使用酶标仪在 450 nm 处针对 620 nm 的参考波长 (A 450 -A 620 )测量吸光度。此外,在无血清培养条件下在 HEK293-6E 细胞中产生的重组蛋白在考马斯染色后通过 SDS-PAGE 进行定量。在还原条件下制备样品,并使用分析软件与纯化的标准蛋白质进行比较。

  用基于膜的酶分析仪对葡萄糖和 L-乳酸进行定量。同时酶标仪也可用于测量 L-谷氨酰胺与 L-谷氨酸的组合。返回搜狐,查看更多


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